Entwickelte E. coli Nissle 1917 zur Abgabe von bioaktivem IL

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12506 (2023) Diesen Artikel zitieren

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In dieser Studie haben wir eine schrittweise Optimierung von biologisch aktivem IL-2 für die Abgabe mithilfe von E. coli Nissle 1917 durchgeführt. Die Entwicklung des Stammes wurde mit einem In-vitro-Zelltest gekoppelt, um die biologische Aktivität von mikrobiell produziertem IL-2 (mi) zu messen -IL2). Als nächstes bewerteten wir das immunmodulatorische Potenzial von mi-IL2 mithilfe eines 3D-Tumorsphäroidmodells, das einen starken Effekt auf die Aktivierung von Immunzellen zeigte. Schließlich bewerteten wir die Antikrebseigenschaften des gentechnisch veränderten Stamms in einem murinen CT26-Tumormodell. Der manipulierte Stamm wurde intravenös injiziert und besiedelte selektiv Tumore. Die Behandlung wurde gut vertragen und die Tumore der behandelten Mäuse zeigten eine leichte Verringerung der Tumorwachstumsrate sowie deutlich erhöhte IL-2-Spiegel im Tumor. Diese Arbeit demonstriert einen Arbeitsablauf für Forscher, die daran interessiert sind, E. coli Nissle für eine neue Klasse mikrobieller Therapie gegen Krebs zu entwickeln.

In den letzten Jahrzehnten wurden erhebliche Fortschritte bei Therapien erzielt, die das Immunsystem zur Krebsbekämpfung nutzen. Im Gegensatz zur Chemotherapie oder Strahlentherapie sind Immuntherapeutika nicht direkt toxisch für Krebszellen. Stattdessen aktivieren diese Medikamente die Immunzellen oder weisen sie an, Krebszellen zu erkennen und abzutöten. Aufgrund ihrer Wirksamkeit entwickelt sich die Immuntherapie schnell zu einer wirksamen Erstlinienbehandlung gegen Krebs1. Interessanterweise reichen die Ursprünge dieser Behandlungsmethode bis ins 18. Jahrhundert zurück. Die ersten berichteten Beobachtungen wurden gemacht, nachdem Krebspatienten mit bakteriellen Infektionen eine signifikante Tumorregression zeigten2. Auf diese Beobachtungen folgten Versuche, bakterielle Therapien zur Behandlung von Krebs zu entwickeln, die Ergebnisse dieser Studien waren jedoch nicht schlüssig3. Obwohl das Konzept, Bakterien zur Modulation der Immunantwort einzusetzen, aufgegeben wurde, lieferten diese Experimente die ersten groben Demonstrationen eines Versuchs, Krebs durch Nutzung des Immunsystems mithilfe bakterieller Therapien zu behandeln.

Nach der Beobachtung, dass bestimmte Bakterien bei intravenöser Injektion selektiv Tumore besiedeln können, kam es in jüngster Zeit zu einem Wiederaufleben bakterieller Immuntherapiestrategien4,5. Trotz umfangreicher präklinischer Beweise6,7,8 ist die Übertragung bakterieller Immuntherapien auf den Menschen noch nicht erfolgt. Fortschritte in der synthetischen Biologie bieten jedoch die Möglichkeit, diese Tumorbakterien zu modifizieren, um ihre Fähigkeiten für therapeutische Anwendungen zu verbessern.

Der Einsatz gentechnisch veränderter Mikroben für therapeutische Anwendungen, auch Advanced Microbial Therapeutics (AMTs) genannt, ist eine vielversprechende Strategie für die lokale Abgabe bioaktiver Moleküle und Proteine im menschlichen Körper. Bakterien können sich an verschiedenen Stellen des menschlichen Körpers ansiedeln und dort leben, beispielsweise in der Haut, im Darm und sogar in Tumoren9. Auf diese Weise wurde Salmonella typhimurium umfassend auf die Produktion bioaktiver Verbindungen in der Tumormikroumgebung untersucht10,11,12,13. Dies ist besonders nützlich für die lokale Verabreichung von Proteinen mit einer kurzen Halbwertszeit oder Proteinen, die zu toxisch sind, um systemisch verwendet zu werden. Eine solche Klasse von Proteinen sind Zytokine14.

Zytokine sind kleine Signalproteine, die dabei helfen, die Immunantwort zu koordinieren. Sie umfassen eine große Familie von Proteinen, die von verschiedenen Zelltypen abgesondert werden und Signalwirkungen sowohl auf Immunzellen als auch auf andere Zelltypen ausüben14. Das Zytokin IL-2 ist ein starker Wachstumsfaktor von T-Zellen und natürlichen Killerzellen (NK-Zellen)15,16. Die IL-2-Stimulation ist entscheidend für die Aktivierung und Differenzierung von T-Zellen und NK-Zellen hin zu einem zytotoxischen und Effektor-Phänotyp. CD8+ T-Zellen und NK-Zellen sind wichtige Effektorzellen, die an der direkten Abtötung von Krebszellen beteiligt sind. Es gibt jedoch zunehmend Hinweise darauf, dass CD4+-T-Zellen auch eine Schlüsselrolle bei der Unterstützung der Antitumoraktivität von CD8+-T-Zellen spielen, indem sie Zytokine produzieren, die für ihre Aktivierung und Differenzierung erforderlich sind, und Krebszellen bei der Erkennung von Tumorantigenen im Zusammenhang damit direkt abtöten Haupthistokompatibilitätskomplex II17,18. Daher ist IL-2 ein wichtiger Stimulationsfaktor, um die Zytotoxizität von Immunzellen gegenüber Krebszellen voranzutreiben. Der klinische Einsatz von IL-2 ist jedoch aufgrund seiner hohen systemischen Toxizität, der kurzen Halbwertszeit im Plasma und der geringen Penetration in den Zielbereich begrenzt19,20.

Die intratumorale IL-2-Verabreichung mithilfe manipulierter Mikroben wurde zuvor unter Verwendung von Salmonella typhimurium21 und Clostridium-Arten22,23 untersucht. Jüngste Studien haben jedoch gezeigt, dass probiotische Escherichia coli Nissle 1917 (EcN)-Bakterien auch Tumore besiedeln können und möglicherweise ein besseres Sicherheitsprofil als S. typhimurium aufweisen24. Darüber hinaus wurden E. coli-Stämme zuvor verwendet, um therapeutische Peptide in vivo in der Tumormikroumgebung abzugeben25,26,27.

In dieser Studie stellen wir einen AMT vor, der für die lokale Abgabe von IL-2 direkt in solide Tumoren unter Verwendung des probiotischen EcN konzipiert ist. Wir haben eine Stammoptimierung durchgeführt, um die Produktion von bioaktivem IL-2-Protein außerhalb der Zelle zu steigern. Es wurden mehrere Optimierungsrunden durchgeführt und die Fähigkeit des vielversprechendsten Kandidaten, die Zytotoxizität von Immunzellen zu stimulieren, wurde mit einem 3D-Tumor-Sphäroid-Assay bestimmt. Schließlich wurden die Antikrebseigenschaften des vielversprechendsten Stamms in vivo anhand eines syngenen CT26-Dickdarmkarzinom-Tiermodells validiert. Die Ergebnisse zeigten die Fähigkeit des optimierten Stamms, die Tumormikroumgebung zu modulieren, indem er die intratumoralen IL-2-Spiegel verdoppelte und die Wachstumsrate von Tumoren moderat verlangsamte.

Gramnegative Bakterien wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, sich in der Mikroumgebung des Tumors anzusiedeln und zu vermehren4,5. In dieser Studie haben wir das probiotische EcN als Plattformstamm ausgewählt, um die Fähigkeit zu entwickeln, IL-2 direkt in die Mikroumgebung des Tumors zu transportieren. In EcN ist SecB der dominierende Sekretionsweg, der die Translokation vorzeitig entfalteter Proteine in das Periplasma durchführt, wo die Proteinfaltung stattfindet28. Dementsprechend wählten wir das SecB-abhängige Signalpeptid von OmpA als unseren Referenzstamm, da dieser Tag zuvor für die Translokation von Proteinen in die extrazelluläre Umgebung verwendet wurde29. Als nächstes klonierten wir mehrere SecB-Signalpeptide (Tabelle 1) in den N-Terminus von IL-2 (Abb. 1A). Die Konstrukte enthielten außerdem einen C-terminalen Hexahistidin-Tag (His6) zur Reinigung und Quantifizierung. Von allen untersuchten Signalpeptiden zeigte nur LamB eine Verbesserung der extrazellulären Titer von IL-2 im Vergleich zum Ausgangskonstrukt mit dem OmpA-Signalpeptid (Abb. 1A rote Balken).

Die Optimierung des Signalpeptids und des Löslichkeits-Tags führt zu einer höheren Zytokinproduktion und -aktivität im Überstand. (A) Verschiedene Signalpeptide wurden stromaufwärts des IL-2-His6-Gens kloniert. Bakterienüberstände wurden gesammelt und die IL-2-Spiegel im Überstand wurden mit einem IL-2-ELISA-Kit gemessen (in rot dargestellt). Die Aktivität von IL-2 in den Überständen wurde mithilfe des CTLL-2-Aktivitätstests gemessen. RFUs, die auf nicht exprimierende Bakterien normalisiert sind, werden angezeigt (blau dargestellt). (B) Der InfB-Löslichkeitstag wurde an den N- oder C-Terminus des Zytokins kloniert. Die Überstände wurden gesammelt und das IL-2-Signal mittels ELISA gemessen (in rot dargestellt). Die Aktivität von IL-2 in den Überständen wurde mithilfe eines CTLL-2-Aktivitätstests gemessen. RFUs, die auf nicht exprimierende Bakterien normalisiert sind, werden angezeigt (blau dargestellt). Dargestellt sind Werte aus drei biologischen Replikaten mit Standardabweichungen. *Für weitere Experimente wurde der LamB-Stamm mit C-terminalem InfB-Tag ausgewählt. Relative RFU-Fluoreszenzeinheit, RBS-Ribosomenbindungsstelle, Sig-Peptid-Signalpeptid, His6-Hexahistidin-Tag.

Obwohl Proteintiter ein gutes Maß für die Stammoptimierung sind, korrelieren sie nicht unbedingt mit der Aktivität des exprimierten Proteins. Daher ist die Messung der Proteinaktivität notwendig, um die Menge des produzierten funktionellen Proteins zu bestimmen. Die IL-2-Aktivität wurde mit einem Aktivitätstest unter Verwendung von CTLL-2-Zellen gemessen, der die aktiven IL-2-Spiegel dosisabhängig bestimmt. Interessanterweise beobachteten wir, dass die Proteinspiegel von IL-2 nicht mit den mit CTLL-2-Zellen bestimmten Aktivitätsspiegeln korrelierten (Abb. 1A blaue Balken). Obwohl OmpC niedrige IL-2-Titer aufwies, behielt es die gleiche biologische Aktivität wie der Referenzstamm OmpA. Umgekehrt führte die Verwendung des LamB-Signalpeptids zu einem Anstieg der IL-2-Titer um etwa 50 %; Allerdings stieg die Aktivität des Proteins nicht in gleicher Weise an. Diese Ergebnisse deuten auf eine hohe Variabilität der Menge an biologisch aktivem IL-2 hin, das im Überstand der verschiedenen Expressionskonstrukte produziert wird. Darüber hinaus zeigten die Stämme eine unterschiedliche Stoffwechselbelastung, die nicht mit der Menge an produziertem IL-2 im Medium korrelierte (ergänzende Abbildung S1A).

Wir vermuteten, dass die niedrigen IL-2-Titer eine Folge der Aggregation von fehlgefaltetem IL-2 zu Einschlusskörpern sein könnten – ein häufiges Problem bei der Expression heterologer Proteine in E. coli33. Daher wurden sechs Stämme ausgewählt, um die Proteinfaltung und die Aktivität von IL-2 zu verbessern, das von verschiedenen Signalpeptiden (OmpA, LamB, OmpF, OmpC, PhoA und OmpT) produziert wird. Wir haben das InfB-Löslichkeits-Tag34 am N- oder C-Terminus von IL-2 kloniert (Abb. 1B). Die Zugabe des InfB-Löslichkeitsmarkers führte im Allgemeinen zu höheren Titern der IL-2-Produktion im Überstand. Der Stamm OmpA mit C-terminalem InfB zeigte die höchste Verbesserung mit einem achtfachen Anstieg der gesamten IL-2-Proteinspiegel im Überstand (Abb. 1B rote Balken). OmpC- und LamB-Stämme mit N-terminalem InfB zeigten ebenfalls höhere IL-2-Spiegel, mit einem 3,5- bzw. fünffachen Anstieg. Während OmpA mit dem C-terminalen InfB-Löslichkeitsmarker die höchste Menge an Gesamt-IL-2 aufwies, zeigte es eine geringe IL-2-Aktivität, was darauf hindeutet, dass der Großteil des produzierten Zytokins inaktiv ist (Abb. 1B blaue Balken). Interessanterweise waren die Stämme PhoA mit N-terminalem InfB und LamB mit C-terminalem InfB-Tag eine erhöhte aktive IL-2-Produktion. Der PhoA-Stamm zeigte jedoch eine hohe Variabilität in der Wachstumsleistung und hatte höhere Fitnesskosten (ergänzende Abbildung S1B). Unter Berücksichtigung sowohl der Stammfitness als auch der aktiven IL-2-Produktion wurde der Stamm LamB mit C-terminalem InfB als vielversprechendster Kandidat ausgewählt.

Schließlich wurde das LamB-Konstrukt mit dem C-terminalen InfB-Löslichkeits-Tag unter der Expression verschiedener Promotoren kloniert (Tabelle 2, ergänzende Abbildung S2). Wir haben die konstitutiven Promotoren MS6 und MS8 ausgewählt, da sie Teil einer Bibliothek sind, die zuvor für eine konsistente Expression in vivo entwickelt wurde (Armetta et al. 202135). Das Ändern des Promotors führte zu keinem Anstieg der IL-2-Titer oder -Aktivität, verursachte jedoch einen Fitnessaufwand für die Stämme (ergänzende Abbildung S1C). Daher fuhren wir mit dem Stamm unter Verwendung des Anderson-Promotors J23107 fort. Insgesamt haben wir uns für diesen Stamm entschieden, da er in der Lage war, hohe Mengen an funktionell aktivem IL-2 zu produzieren, ohne die Fitness des Stammes wesentlich zu beeinträchtigen. Von nun an bezeichnen wir mikrobiell produziertes IL-2 aus dem optimierten LamB-InfB-Stamm als mi-IL2.

IL-2 ist ein grundlegendes Zytokin für die Aktivierung krebstötender Immunzellen wie CD8+T-Zellen und NK-Zellen36,37. Somit fördert IL-2 eine immunologische Reaktion, indem es die Produktion von Proteinen induziert, die an der direkten kontaktvermittelten Zytotoxizität beteiligt sind, wie Granzyme, Perforin und Fas-Ligand (FasL)38,39. Um die Fähigkeit von mi-IL2 zu bestimmen, eine zu induzieren Um die Antitumor-Immunantwort zu verbessern, wurde ein 3D-Tumor-Sphäroid-Assay etabliert. Der Überstand des Stammes mi-IL2 wurde mit menschlichen Immunzellen (PBMCs) und einem einzelnen HT29-Tumorsphäroid inkubiert. mi-IL2 wurde den Co-Kulturen in einer Endkonzentration von ~ 1 ng/ml zugesetzt. Als Positiv- bzw. Negativkontrolle (Neg.Strg) wurden gereinigtes IL-2 oder Überstände von nicht exprimierenden Bakterien verwendet. Gereinigtes IL-2 zeigte eine dosisabhängige Aktivierung der Zytotoxizität von Immunzellen und eine Destabilisierung der Sphäroide (Abb. 2A, B). Nach 72 Stunden induzierten die mi-IL2 ausgesetzten PBMCs die gleichen Toxizitätsniveaus wie das gereinigte IL-2. Darüber hinaus zeigte die visuelle Analyse der Tumorsphäroidintegrität mit mi-IL2 ähnliche Ergebnisse wie 10 ng/ml IL-2 (Abb. 2B).

Die mit immunzellvermittelter Zytotoxizität verbundene Genexpression wird durch den Überstand von mi-IL2 induziert. (A) Die Zytotoxizität wurde anhand von Co-Kulturen gemessen, die gereinigtem IL-2 oder Überstand von mi-IL2 ausgesetzt waren, unter Verwendung von Cytotox Green und dem Incucyte-Bildgebungssystem. Für jede Erkrankung wurden drei Sphäroide analysiert. Als Negativkontrolle (Neg.Ctrl) wurde der Überstand nicht exprimierender Bakterien verwendet. (B) Repräsentative Bilder der Sphäroidintegrität nach 3 Tagen Co-Kultur. (C) RT-qPCR-Analyse von IL-2-Antwortgenen aus der Co-Kultur von Tumorsphäroiden und PBMC. Die Genexpression wurde auf die GAPDH-Expression normalisiert. Dargestellt sind Mittelwerte der relativen Genexpression und des SEM aus drei unabhängigen Experimenten. qPCR-Primersequenzen sind in Tabelle 3 aufgeführt. (D) IFNγ-Spiegel aus den Tumorsphäroid- und PBMC-Kokulturen. Die Proteingehalte wurden mittels ELISA gemessen. Dargestellt sind Mittelwerte der Proteingehalte und SEM aus drei unabhängigen Experimenten. Signifikanz bestimmt mit ANOVA und Post-hoc-Analyse des Vergleichs zwischen Gruppen unter Verwendung des Tukey-Honest-Significant-Difference-Tests: (ns) p > 0,05, *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001.

Als nächstes wollten wir untersuchen, ob mi-IL2 auf molekularer Ebene die Expression von Genen induzieren würde, die mit immunzellvermittelter Zytotoxizität verbunden sind, und zwar über denselben Mechanismus wie gereinigtes IL-2. Daher haben wir das Genexpressionsprofil in den Tumorsphäroid- und PBMC-Kokulturen nach 24-stündiger Exposition durch RT-qPCR bestimmt (Primer in Tabelle 3 aufgeführt). Gereinigtes IL-2 zeigte eine dosisabhängige Hochregulierung von Genen, die mit der Abtötung von Immunzellen verbunden sind (Abb. 2C). 10 ng/ml IL-2 steigerten die Expression von IFNG, FASLG, GZMA und PRF1 signifikant, während die Exposition gegenüber 1 ng/ml gereinigtem IL-2 zu niedrigeren Expressionsniveaus dieser Gene führte. Interessanterweise führten Co-Kulturen, die mi-IL2 ausgesetzt waren, zu einer starken Genaktivierungssignatur, die der von 10 ng/ml gereinigtem IL-2 ähnelte. Dies war unerwartet, da die Gesamtkonzentration von mi-IL-2 etwa zehnmal niedriger war, die Zellen jedoch eine stärkere Hochregulierung der Zielgene aufwiesen. Insgesamt scheint mi-IL2 eine stärkere Zielgenaktivierung zu fördern, als aufgrund seiner Konzentration zu erwarten wäre.

Nachdem wir bei der Stimulation mit mi-IL2 eine erhöhte IFNG-Genexpression festgestellt hatten, wollten wir die Konzentrationen des Genprodukts Interferon-γ (IFNγ) im Überstand der Co-Kulturen bestimmen. IFNγ ist ein wichtiges Zytokin für immunologisch vermittelte Antitumorreaktionen. IFNγ kann Tumorzellen direkt beeinflussen, indem es antiproliferative und antiangiogene Wirkungen ausübt, sowie indirekt, indem es die tumorizide Aktivität von Makrophagen erhöht und andere Immunzellen anzieht40. Wir haben die IFNγ-Spiegel in den konditionierten Medien aus der Co-Kultur von PBMCs und Tumorsphäroiden quantifiziert. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Genexpression stiegen die IFNγ-Spiegel mit der Stimulation mit gereinigtem IL-2 dosisabhängig an (Abb. 2D). Allerdings produzierten mit mi-IL2 stimulierte Zellen dreimal mehr INFγ im Vergleich zu 10 ng/ml gereinigtem IL-2. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass mi-IL2 eine stärkere immunzellaktivierende Wirkung hat.

Die Antitumorwirkung des EcN-Stamms, der mi-IL2 exprimiert (EcN mi-IL2), wurde an tumortragenden CB6F1-Mäusen untersucht. Mit CT26-Tumoren transplantierte Mäuse wurden mit einer einzigen intravenösen Injektion von PBS, nicht exprimierenden EcN-Bakterien (EcN Ctrl) oder EcN mi-IL2 behandelt (Abb. 3A). Obwohl keine starke Antitumorwirkung beobachtet wurde, zeigte die Querschnittsanalyse, dass mit EcN mi-IL2 behandelte Mäuse am 2. und 4. Tag kleinere Tumoren aufwiesen (Abb. 3B). Eine Längsschnittanalyse mit einem linearen Regressionsmodell zeigte ein langsameres Tumorwachstum bei Tieren, die mit EcN mi-IL2 behandelt wurden, nicht jedoch bei der EcN Ctrl-Gruppe (Abb. 3C).

EcN mi-IL2 verlangsamt das Wachstum von CT26-Tumoren. CB6F1-Mäuse, die CT26-Tumoren auf beiden Flanken trugen, wurden intravenös mit PBS oder 1 × 108 KBE Bakterien behandelt. Mäuse wurden getötet, als die Tumoren 2000 mm3 erreichten. (A) Studiendesign. Figur hergestellt mit Biorender gemäß der Vereinbarung Nr. YB25KBCY7U. (B) CT26-Tumorvolumina aller Mäuse, die mit PBS (n = 12), EcN Ctrl (n = 6) und EcN mi-IL-2 (n = 8) behandelt wurden. Dargestellt ist das mittlere Tumorvolumen mit SEM. Signifikanz bestimmt mit ANOVA und Post-hoc-Analyse des Vergleichs zwischen Gruppen unter Verwendung des Tukey-Honest-Significant-Difference-Tests: (ns) p > 0,05, *p ≤ 0,05. (C) Längsschnittanalyse der Wachstumsrate von Tumoren mithilfe eines linearen Regressionsmodells. Das 95 %-Konfidenzintervall der Koeffizientenschätzungen wird angezeigt. Die Interpretation der Modellausgabe ist die Änderung der Wachstumsrate von Tumoren im Vergleich zur PBS-Gruppe. (D) IL-2-Spiegel in kolonisierten Tumoren mit Mittelwert und SEM dargestellt.

Frühere Experimente zeigten, dass der EcN mi-IL2-Stamm im Vergleich zu WT-EcN eine minimale Stoffwechselbelastung aufwies; Daher gingen wir davon aus, dass die Effizienz der Tumorbesiedelung der des EcN Ctrl-Stamms ähnlich sein würde. Wir beobachteten jedoch eine geringere Kolonisierung des EcN mi-IL2 im Vergleich zum EcN Ctrl. Alle Tumoren waren in der EcN Ctrl-Gruppe besiedelt, während in der EcN mi-IL2-Gruppe nur die Hälfte der Tumoren nachweisbare Bakterien aufwies (ergänzende Abbildung S3).

Die Produktion von mi-IL2 in der Mikroumgebung des Tumors ist wichtig, um eine therapeutische Wirkung zu beobachten. Tumoren mit bakterieller Besiedlung wurden homogenisiert und die IL-2-Spiegel gemessen. Die IL-2-Spiegel wurden bei allen PBS-Tumoren und kolonisierten Tumoren der EcN Ctrl- und mi-IL2-Gruppen gemessen. Wie erwartet unterschieden sich die IL-2-Spiegel zwischen den PBS- und EcN-Control-Gruppen nicht (Abb. 3D), während die IL-2-Spiegel in Tumoren aus der ECN-mi-IL2-Gruppe signifikant höher waren, mit einem etwa zweifachen Anstieg der Konzentration von intra- Tumor-IL-2.

Um zu beurteilen, ob EcN mi-IL2 einen Einfluss auf die Zusammensetzung der Immunzellen des CT26-Mausmodells hatte, führten wir eine Phänotypisierungsanalyse an aus Milzen und Tumoren isolierten Immunzellen durch (Antikörper in Tabelle 4 aufgeführt). Es gab keine Unterschiede in der B- oder NK-Zellpopulation zwischen den Gruppen in der Milz und auch nicht in den Tumoren (ergänzende Abbildung S4A, B). Allerdings waren die CD4+-T-Zellzahlen in Tumoren sowohl in der EcN Ctrl- als auch in der EcN mi-IL2-Gruppe höher als in PBS (ergänzende Abbildung S4B). Darüber hinaus kam es in der EcN Ctrl-Gruppe zu einem Rückgang der CD8+ T-Zellen. In der Milz der EcN mi-IL-2-Gruppe wurden erhöhte Konzentrationen an CD4+-T-Zellen im zentralen Gedächtnis und Effektor-Gedächtnis-T-Zellen beobachtet (ergänzende Abbildung S4C). In den Tumoren waren die CD4+-T-Zellspiegel zwischen den PBS- und EcN-mi-IL-2-Gruppen ähnlich, waren jedoch in der EcN-Control-Gruppe verringert (ergänzende Abbildung S4D). Die CD8+-T-Zelldifferenzierung unterschied sich zwischen den Gruppen in Milz und Tumoren nicht (ergänzende Abb. S4E, F).

Bakterien, die für die lokale Produktion bioaktiver Verbindungen entwickelt wurden, sind ein vielversprechender Ansatz für die Krebsbehandlung41,42,43, insbesondere für Zytokine, die für eine systemische Verabreichung zu toxisch sind. In bestimmten Fällen kann es jedoch schwierig sein, therapeutische Mengen biologisch aktiver Zytokine in Bakterien zu exprimieren44,45. Die korrekte Proteinfaltung und posttranslationale Modifikationen sind entscheidend für den Erhalt ihrer biologischen Aktivität. Daher haben wir einen therapeutischen EcN-Stamm für die In-situ-Produktion und Abgabe von biologisch aktivem IL-2 optimiert. Um höhere Konzentrationen an aktivem IL-2 zu erhalten, waren Modifikationen des Signalpeptids und des Löslichkeits-Tags erforderlich (Abb. 1). Wir verwendeten einen zellbasierten Assay mit CTLL-2-Zellen, um die IL-2-Aktivität in den Überständen zu bestimmen. In jedem Schritt der Optimierung wurde die gesamte IL-2-Produktion mit den Aktivitätsniveaus im In-vitro-Assay verglichen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine höhere IL-2-Produktion nicht unbedingt die Menge an aktivem IL-2 im Überstand erhöht. Dies könnte durch einen Engpass bei der korrekten Faltung oder der Bildung von Disulfidbindungen erklärt werden, was dazu führt, dass mehr Protein inaktiv ist. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung einer Feinabstimmung der Expressionsniveaus in therapeutischen Mikroben, um biologisch aktive Proteine bereitzustellen.

In unserer Studie verwendeten wir SecB-abhängige Signalpeptide, um die Translokation von Proteinen in das Periplasma zu erleichtern. Obwohl dieser Ansatz häufig für die extrazelluläre Proteinproduktion verwendet wird, ist der genaue Mechanismus, der der Bewegung von mi-IL2 in die extrazelluläre Umgebung zugrunde liegt, noch unklar. Frühere Studien haben berichtet, dass Proteine, die diese Signalpeptide tragen, sich in einer SecB-abhängigen Weise außerhalb der Zelle lokalisieren können29,46. Während sich die bakterielle Lyse als plausibler Weg für mi-IL2 zum Zugang zur extrazellulären Umgebung herausstellt, konnten wir im Vergleich zur EcN-Kontrolle keine nennenswerten nachteiligen Auswirkungen auf das Wachstum oder die Fitness des mi-IL2-Stammes beobachten (ergänzende Abbildung S1). Zukünftige Studien zur Optimierung der mikrobiellen Abgabe therapeutischer Peptide und Proteine erfordern ein besseres Verständnis des genauen Mechanismus, durch den Proteine in die extrazelluläre Umgebung transloziert werden.

Eine weitere Überlegung bei der Entwicklung einer therapeutischen Mikrobe ist die Fitness und Lebensfähigkeit des Stammes. In einer therapeutischen Mikrobe werden die Ressourcen, die für das Wachstum genutzt werden könnten, für die Produktion heterologer Proteine umgeleitet, was die Stoffwechselbelastung erhöht. Dies kann wiederum zu einem langsameren Wachstum und einer geringeren Fitness führen47. Die verminderte Fitness kann die Fähigkeit von Bakterien beeinträchtigen, im Wirt und in der Mikroumgebung des Tumors zu überleben und sich dort anzusiedeln. Daher haben wir in dieser Arbeit die Fitnesskosten des Stammes während des Optimierungsprozesses berücksichtigt (ergänzende Abbildung S1), mit dem Ziel, die Mengen an heterologem bioaktivem Protein und die Fitnesskosten des Stammes auszugleichen.

Mithilfe unseres 3D-Zellkulturassays konnten wir zeigen, dass mikrobielles IL-2 wirksamer ist als das gereinigte Protein. Die gleichen Zielgene wurden in mi-IL2 und gereinigtem IL-2 hochreguliert (Abb. 2C), was darauf hinweist, dass der Wirkungsmechanismus IL-2-abhängig ist. Allerdings zeigte mi-IL2 eine stärkere Wirkung bei der Aktivierung von Immunzellen als gereinigtes IL-2, obwohl die Proteingehalte zehnmal niedriger waren. Konditionierte Medien aus Bakterien enthalten nicht nur IL-2, sondern auch andere immunogene Moleküle aus Bakterien, wie Lipopolysaccharid (LPS), die als Adjuvans wirken können. Berichten zufolge wirkt LPS synergistisch mit IL-2 bei der Steigerung der IFNγ-Produktion und Zytotoxizität48. Daher könnte die additive Wirkung von bakteriell produziertem IL-2 zusammen mit LPS und anderen immunogenen Molekülen die therapeutische Reaktion verbessern.

Die Behandlung mit EcN mi-IL2 hatte bei Mäusen mit CT26-Tumoren keine starke therapeutische Wirkung. Einige mit EcN mi-IL2 behandelte Tumoren reagierten nicht auf die Behandlung, was zu einer höheren Variabilität führte. Dennoch wurden zu frühen Zeitpunkten ein langsameres Tumorwachstum und höhere IL-2-Spiegel in den Tumoren beobachtet (Abb. 3). Es wurde zuvor berichtet, dass eine E. coli TOP10- und EcN-Infektion von BALB/c-Mäusen, die CT26-Tumoren tragen, zu einer durch CD8+ T-Zellen vermittelten Tumorclearance führt24,49. In unserem CB6F1-Mausmodell sahen wir eine Abnahme intratumoraler CD8+ T-Zellen bei Mäusen, die mit nicht exprimierendem EcN (EcN Ctrl) behandelt wurden, wohingegen die Mäuse aus der EcN mi-IL2-Gruppe die gleichen Werte an gesamten CD8+ T-Zellen aufwiesen wie die PBS-Gruppe (Ergänzende Abbildung S4B). Es ist möglich, dass in unserem Mausmodell CD8+-T-Zellen bei einer Infektion mit Bakterien nicht aktiviert werden, wie die mäßige therapeutische Wirkung des Stamms zeigt. Schließlich wird die Zytokinabgabe in die Tumormikroumgebung durch eine geringe Tumorbesiedelung beeinträchtigt und somit die therapeutische Wirksamkeit der Behandlung beeinträchtigt. Wir stellten die Hypothese auf, dass ein Stamm mit einem besseren Wachstumsprofil zu einer stabilen Besiedlung der Tumormikroumgebung führen würde. Beispielsweise zeigte der Stamm EcN Ctrl während des gesamten Experiments eine sehr stabile Besiedlung von Tumoren. Im Gegensatz dazu zeigte der Stamm EcN mi-IL2 eine verminderte Tumorbesiedlung (ergänzende Abbildung S3), obwohl das Wachstumsprofil dem des Stammes EcN Ctrl ähnlich war (ergänzende Abbildung S2). Leider kann die Wachstumsprofilierung im Labor die Bedingungen, die das Überleben der Bakterien in der Mikroumgebung des Tumors beeinflussen, nicht vollständig nachbilden. Darüber hinaus könnte die Expression immunzellaktivierender Zytokine auch einen Einfluss auf die bakterielle Besiedlung haben. Beispielsweise wurde berichtet, dass die bakterizide Aktivität von Makrophagen gegen S. typhimurium durch IL-2-Stimulation erhöht wurde50. Möglicherweise fördern die Zytokin-exprimierenden Bakterien ihre eigene Eliminierung, indem sie Makrophagen oder andere bakterientötende Zellen aktivieren. Es ist nicht klar, ob die schlechte Tumorbesiedelung auf die metabolische Belastung durch die Zytokinexpression oder auf die immunologische Wirkung des Zytokins zurückzuführen ist. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die spezifischen Auswirkungen zu ermitteln, die dieses Phänomen verursachen. Die wiederholte Verabreichung von Bakterien könnte jedoch eine mögliche Lösung sein.

Die intratumorale IL-2-Verabreichung wurde bereits zuvor mit S. typhimurium mit vielversprechenden präklinischen Ergebnissen untersucht21. Allerdings hatte S. typhimurium, der IL-2 produziert, in klinischen Studien keine signifikante Wirkung51. Ein weiterer Vorbehalt besteht darin, dass S. typhimurium ein pathogenes Bakterium ist, das abgeschwächt werden muss52. Auch andere bakterielle Chassis wurden für die IL-2-Abgabe untersucht, darunter Clostridium-Arten. In diesen Studien konnte jedoch keine Wirksamkeit bei der Behandlung von Krebs in vivo nachgewiesen werden22,23. Darüber hinaus optimierten diese Studien weder die höchste IL-2-Aktivität in Bakterienüberständen noch die optimalen Fitnesskosten des Stammes. Wie wir in unserer Arbeit gezeigt haben, führt eine höhere Gesamtproduktion von IL-2 außerhalb der Zelle nicht unbedingt zu einem aktiveren IL-2. Darüber hinaus verändern unterschiedliche Signalpeptide oder das Hinzufügen von Löslichkeitsmarkierungen nicht nur die aktive IL-2-Produktion im Überstand, sondern auch die Fitnesskosten des Stammes. Daher argumentieren wir, dass Stämme für die höchste IL-2-Aktivität und nicht für die gesamten IL-2-Spiegel in den Überständen optimiert werden sollten.

In dieser Arbeit demonstrieren wir die Machbarkeit von EcN für die In-situ-Abgabe von IL-2 als potenzielle Immuntherapie. Obwohl IL-2 bereits in E. coli exprimiert wurde, ist dies unseres Wissens nach die erste Arbeit, die eine intratumorale Verabreichung von IL-2 zur Krebstherapie zeigt. Um eine stärkere therapeutische Wirkung zu erzielen, sind jedoch weitere Optimierungen erforderlich. Zukünftige Anwendungen könnten eine weitere Optimierung der Stämme, komplexere genetische Schaltkreise mithilfe von Biosensoren53 oder die Koexpression anderer therapeutischer Peptide umfassen, die eine synergetische Antikrebswirkung ausüben könnten. Obwohl der Weg zur klinischen Anwendung noch einige Herausforderungen mit sich bringt, wird diese Arbeit der Gesellschaft zugute kommen, indem sie uns einer sichereren und gezielteren Bereitstellung von Therapeutika näher bringt, um Krankheiten auf transformative und zielorientierte Weise zu behandeln.

Zur Expression der Zytokine wurde das native E. coli Nissle 1917-Plasmid pMut1 verwendet. Das Plasmid wurde zuvor modifiziert, um ein Kanamycin-Resistenzgen zur Antibiotika-Selektion einzufügen. Das Plasmidrückgrat wurde mit einem Phusion High-Fidelity-PCR-Mastermix mit Primern, die für den relevanten Promotor, das Signalpeptid oder den Löslichkeitstag kodierten, PCR-amplifiziert (Tabellen 1, 2). Die PCR-Fragmente würden 20–25nt Überhänge mit den DNA-Sequenzen erzeugen, die die Zytokine kodieren. DNA-Sequenzen, die die Zytokine kodieren, wurden von UniProt übernommen. Das IL-2-Gen wurde für E. coli codonoptimiert und von IDT synthetisiert. Die Konstrukte wurden mithilfe der Gibson-Assemblierung gemäß den Empfehlungen des Herstellers in das pMut1-Plasmid kloniert. Nach der Gibson-Assemblierung wurden die Plasmide entweder unter Verwendung elektrokompetenter oder chemisch kompetenter Zellen in den Stamm E. coli TOP10 transformiert. Die richtigen Stämme wurden durch Kolonie-PCR und Sanger-Sequenzierung ausgewählt. Plasmide wurden aus TOP10-Bakterien gereinigt und in elektrokompetente E. coli Nissle 1917-Bakterien transformiert, um den endgültigen Zytokin-exprimierenden Stamm zu erzeugen.

Das Medium wurde mit 10 % FBS und 50 μg/ml Kanamycin ergänzt. RPMi-Medien wurden zur Herstellung von Überständen für den IL-2-Aktivitätstest verwendet. McCoys 5A-Medium wurde zur Herstellung von Überständen für den 3D-Tumorsphäroid-Zytotoxizitätstest verwendet. Eine einzelne Bakterienkolonie wurde in RPMi- oder McCoy's 5A-Medien inokuliert und über Nacht bei 37 °C unter Schütteln mit 250 U/min gezüchtet. Übernachtkulturen wurden 100-fach in frischem Medium verdünnt und bis zur späten exponentiellen Phase gezüchtet. Die Kulturen wurden 10 Minuten lang bei 4000 × g zentrifugiert und die Überstände wurden unter Verwendung eines 0,22-μm-Spritzenfilters filtersterilisiert. Die Überstände wurden zur weiteren Verwendung bei –20 °C gelagert.

Bakterien- oder Zellkulturüberstände wurden in ELISA-Verdünnungspuffer verdünnt und die Zytokinspiegel wurden mit einem kommerziellen ELISA-Kit (Abcam ab46033) gemäß den Empfehlungen des Herstellers gemessen.

Säugetierzellen wurden in T75-Flaschen aufbewahrt und alle 3–4 Tage subkultiviert. Vollständige Wachstumsmedien enthielten 10 % FBS und 1 % Antibiotika-Cocktail. CTLL-2-Zellen (RRID:CVCL_0227) wurden in vollständigem RPMi-Medium, ergänzt mit 10 % T-Zellkultur-Ergänzung mit ConA (Thermofisher Scientific 11513540), kultiviert. CT-26-Zellen (RRID:CVCL_7254) wurden in vollständigen RPMi-Medien kultiviert. HT29-Zellen (RRID:CVCL_A8EZ) wurden in vollständigen McCoy's5A-Medien kultiviert. Die Zellen wurden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2-Atmosphäre gezüchtet.

CTLL-2-Zellen wurden 5 Minuten lang bei 200 G zentrifugiert und zweimal mit PBS gewaschen, um den IL-2-Kulturzusatz aus dem Medium zu entfernen. Den Zellen wurde IL-2 entzogen, indem sie 5–6 Stunden lang in vollständigem RPMi-Medium ohne IL-2 inkubiert wurden. 2 × 104 Zellen in einem Volumen von 45 μl wurden in jede Vertiefung einer schwarzen Platte mit 96 Vertiefungen und klarem Boden gegeben. 45 μl verdünnter Überstände wurden den Zellen in einer Endkonzentration von 10 % (V/V) zugesetzt. Als Positivkontrolle wurden Medien mit 5 % T-Zellkultur-Ergänzung mit ConA verwendet, da sie IL-2 enthalten. Nach 16 Stunden wurden 10 μl Alamar Blue (Thermofisher Scientific, DAL1025) hinzugefügt und 30 Minuten lang inkubiert. Die Fluoreszenzintensität wurde bei 530 nM Anregungs- und 560 nM Emissionswellenlängen gemessen.

Frische menschliche Buffy Coats wurden von gesunden, anonymisierten Freiwilligen in der Blutbank der Abteilung für klinische Immunologie, Rigshospitalet, Kopenhagen, Dänemark, gewonnen. PBMCs wurden durch Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung von Lymphoprep- und SepMate-50-Röhrchen isoliert. Die Isolierung wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Gefrorene PBMCs wurden zur späteren Verwendung aufbewahrt. PBMCs wurden unmittelbar nach dem Auftauen verwendet.

5000 HT-29-Zellen wurden in einer 96-Well Clear Ultra Low Attachment Microplate (Thermofisher Scientific, 10023683) ausgesät und 10 Minuten lang bei 1000 × g zentrifugiert und in den Inkubator gegeben, um Sphäroide zu bilden. 4 Tage alte Tumorsphäroide wurden mit 1 × 105 menschlichen PBMCs und Überständen von Bakterien (30 % V/V) in einem Volumen von 100 μl co-kultiviert. Als Positivkontrolle wurde humanes rekombinantes IL-2 verwendet (Thermofisher Scientific, PHC0026). 1 μl 30-fach verdünnter grüner Cytotox-Farbstoff (Essen Biosciences, ESS4633) wurde pro Vertiefung hinzugefügt und die Zytotoxizität wurde bis zu 72 Stunden lang mit dem Incucyte S3-Bildgebungssystem für lebende Zellen gemessen. Bilder der Sphäroidintegrität wurden nach 72-stündiger Inkubation aufgenommen. Co-Kulturen wurden fünfmal vorsichtig auf- und abpipettiert, um die pelletierten Zellen aufzurühren, und es wurden sofort Bilder mit dem Incucyte-System aufgenommen.

Humane PBMCs oder Tumorsphäroide + PBMCs wurden 24 Stunden lang mit Bakterienüberständen oder rekombinantem IL-2 (Thermofisher Scientific, PHC0026) inkubiert. Der Test wurde für jede Bedingung unter Verwendung von 12 Vertiefungen einer 96-Well Clear Ultra Low Attachment-Mikrotiterplatte durchgeführt. Die Zellen wurden in einem 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen gepoolt und die Zellen durch 10-minütige Zentrifugation bei 200 × g pelletiert. Der Überstand wurde eingefroren und zur Untersuchung der INFγ-Sekretion mit einem kommerziellen ELISA-Kit (Thermofisher Scientific, 02002) verwendet, und die pelletierten Zellen wurden in TRIzol resuspendiert. Die RNA wurde extrahiert (Zymo Research, R2072) und die Reverse-Transkriptionsreaktion (Thermofisher Scientific 11756050) wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Die cDNA wurde 6-fach mit MiliQ-Wasser verdünnt. 3-stufige qPCR-Reaktionen wurden durch Mischen von 6 μl des 2× qPCR-Mastermixes (Merck, KK4602), 2 μl cDNA und 2 μl qPCR-Primern (3 μM) durchgeführt (Tabelle 3).

Alle Tierversuchsprotokolle wurden gemäß den dänischen Tierschutzrichtlinien durchgeführt. Der Tierversuchsrat der dänischen Tierversuchsinspektion hat die Studienprotokolle mit der Versuchslizenz-Nr. genehmigt. 2017-15-0201-01209. Die Studie wurde gemäß den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt. CB6F1-Mäuse wurden von Envigo gekauft. CT26-Zellen wurden dreimal in PBS gewaschen und 5 × 105 Zellen wurden in jede Flanke der Mäuse geimpft. Die Größe der Tumoren wurde gemessen und das Volumen wurde gemäß der Formel \(\frac{3,14}{6}\times {D1\times D2}^\frac{3}{4}\) berechnet, wobei D1 und D2 sind Maße in Millimetern. Nach 10–12 Tagen, wenn sich Tumore gebildet und eine Größe von mindestens 100 mm3 erreicht hatten, wurde den Mäusen PBS oder 1 × 108 KBE Bakterien in einem Volumen von 100 μl iv injiziert. Das Tumorvolumen und das Mausgewicht wurden dreimal pro Woche gemessen. Mäuse wurden getötet, als die Tumoren ein Volumen von 2000 mm3 erreichten. Aufgrund des schnellen Wachstums einiger Tumoren überschritten einige Mäuse bei der Untersuchung den Grenzwert von 2000 mm3 und wurden sofort getötet. Mäuse wurden durch Zervixluxation getötet und Tumore und Organe wurden präpariert. Präparierte Tumore wurden in kleine Stücke geschnitten und in zwei Röhrchen aufgeteilt, um die Tumorbesiedlung, die Zytokinspiegel und die Immunphänotypisierung zu analysieren.

Nach der Dissektion gleichgroßer Teile des Tumors, der Hälfte der Milz oder der gesamten Leber wurden sie in GentleMACS C-Röhrchen gegeben und mit dem Programm m_Imptumor_01_01 homogenisiert. Zellklumpen wurden entfernt, indem die homogenisierten Proben durch ein 70-μm-Zellsieb gedrückt wurden. Reihenverdünnungen der Organhomogenate wurden auf LB-Platten mit Kanamycin ausplattiert und die bakteriellen KBE wurden am nächsten Tag gezählt. Um die exprimierten Zytokinspiegel in den Tumoren zu quantifizieren, wurden dieselben Organhomogenate 10 Minuten lang bei 5000 × g und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Röhrchen überführt und 15 Minuten lang bei 4 °C und 17.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde bei –80 °C gelagert. Der ELISA wurde mit zweifach verdünnten Überständen durchgeführt, um IL-2 in den Tumoren zu messen. ELISA (Abcam ab46033) wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt.

Für den Tumorverdau wurden 50 μl DNAase I (Sigma-Aldrich, 11284932001) (Stammlösung 600 U/ml) und 0,5 ml Kollagenase IV (Thermofisher Scientific, 2525) (Stammlösung 10 mg/ml) mit kleinen Tumorstücken vollständig inkubiert DMEM in einem Gesamtvolumen von 5 ml. Der Aufschluss erfolgte 45 Minuten lang bei 37 °C unter gründlichem Schütteln. Die Milzen wurden mit GentleMACS C-Röhrchen wie oben beschrieben homogenisiert. Zellklumpen wurden entfernt, indem die homogenisierten Proben durch ein 70-μm-Zellsieb gedrückt wurden. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und die Zellen wurden mit 1 × 107 lebensfähigen Zellen pro Kryoröhrchen eingefroren. Die Medien wurden mit 10 % DMSO ergänzt und RPMi-Medien wurden für Milzen und DMEM-Medien für Tumorzellen verwendet.

Gefrorene Zellen aus Tumoren oder Milzen wurden schnell mit warmem, vollständigem RPMi-Medium aufgetaut und sofort in ein 15-ml-Falcon-Röhrchen mit 9 ml warmem RPMi-Medium überführt. Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei 4 °C und 1500 U/min zentrifugiert und mit Selektionspuffer (1 × PBS, 2 % FBS, 1 mM EDTA) gewaschen. Die Zellen wurden durch ein Filter-FACS-Röhrchen gefiltert und eine positive CD45-Selektion (StemCell Technologies, 18945) wurde nur an den Tumorzellen gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Nach der Selektion wurden die Zellen mit FACS-Puffer (1 × PBS, 2 % FBS) gewaschen und auf eine Platte mit 96 Vertiefungen übertragen. Die Zellen wurden 10 Minuten lang mit 10 μl Fc-Block auf Eis inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit FACS-Puffer gewaschen und mit dem Antikörperpanel (Tabelle 4) 30 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit FACS-Puffer gewaschen und über Nacht bei 4 °C mit 50 μl PFA fixiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen zweimal mit FACS-Puffer gewaschen und durch eine Filterplatte filtriert, bevor sie auf dem Durchflusszytometer liefen. Die Gating-Strategie ist in der ergänzenden Abbildung S5 dargestellt.

Durchflusszytometriedaten sind in der FlowDepository-Datenbank verfügbar. Auf Durchflusszytometriedateien für die Milz-Immunphänotypisierung kann über den Link http://flowrepository.org/id/FR-FCM-Z6KG zugegriffen werden. Durchflusszytometriedateien zur Immunphänotypisierung im Tumor können über den Link http://flowrepository.org/id/FR-FCM-Z6KH abgerufen werden. Weitere Daten sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

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Die Autoren möchten der DTU-Tiereinrichtung für die Unterstützung der Tierstudien danken. Sie möchten der Novo Nordisk Foundation für die Unterstützung dieser Forschung mit dem Challenge-Programm CaMiT unter der Fördernummer NNF17C0028232 danken.

Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technische Universität Dänemark, Lyngby, Dänemark

Sarunas Tumas, Troels Holger Vaaben, Annemette Tengstedt Rasmussen, Ruben Vazquez-Uribe und Morten OA Sommer

Abteilung für Gesundheitstechnologie, Technische Universität Dänemark, Lyngby, Dänemark

Trine Sundebo Meldgaard, Sara Suarez Hernandez und Sine Reker Hadrup

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ST, ATR und THV führten die Klonierung und Optimierung der Stämme durch. ST und TSM führten die Tierstudie durch. SSH führte eine Immunphänotypisierung durch. ST, RVU, MOAS, SRH planten Experimente und schrieben das Manuskript.

Korrespondenz mit Morten OA Sommer.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Thomas, S., Meldgaard, TS, Vaaben, TH et al. Entwickelte E. coli Nissle 1917 zur Bereitstellung von bioaktivem IL-2 für die Krebsimmuntherapie. Sci Rep 13, 12506 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39365-2

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Eingegangen: 4. Januar 2023

Angenommen: 24. Juli 2023

Veröffentlicht: 02. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39365-2

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Entwickelte E. coli Nissle 1917 zur Abgabe von bioaktivem IL